Razlika Med Severnim Južnim In Zahodnim Blottingom

2024 Avtor: Mildred Bawerman | [email protected]. Nazadnje spremenjeno: 2023-12-16 08:42

Ključna razlika - Severni vs Južni vs Zahodni blotting

Odkrivanje posebnih zaporedij DNA, RNA in proteinov je bistvenega pomena za različne vrste študij v molekularni biologiji. Gelna elektroforeza je tehnika, ki ločuje DNA, RNA in beljakovine glede na njihovo velikost. Iz gelskih profilov se s posebnimi tehnikami, imenovanimi blotiranje in hibridizacija z označenimi sondami, zazna posebno zaporedje DNA, zaporedje RNA ali beljakovine. Obstajajo trije različni načini črpanja, in sicer južni, severni in zahodni. Ključna razlika med severnim južnim in zahodnim blotiranjem je v vrsti molekule, ki jo zazna v vzorcu. Southern blot je metoda, ki zazna določeno zaporedje DNA iz vzorca DNA. Northern blot je tehnika, ki zazna določeno zaporedje RNA iz vzorca RNA. Western blot je metoda, ki zazna določeno beljakovino iz vzorca beljakovin.

VSEBINA

1. Pregled in ključna razlika

2. Kaj je južni bloting

3. Kaj je severni bloting

4. Kaj je zahodni bloting

5. Vzporedna primerjava - severni in južni blotting

6. Povzetek

Kaj je Southern Blotting?

Tehniko Southern blot je leta 1975 razvil EM Southern za identifikacijo določenega zaporedja DNA iz vzorca DNA. To je prva tehnika blotiranja, uvedena v molekularni biologiji. Omogočil je odkrivanje specifičnih genov iz DNK, specifičnih fragmentov iz DNA itd. Tehnika južnega blotiranja vključuje več korakov. Ti so naslednji.

1. DNA je izolirana iz vzorca in prebavljena z restrikcijskimi endonukleazami.
2. Prebavljeni vzorec ločimo z elektroforezo v agaroznem gelu.
3. Fragmenti DNA v gelu se denaturirajo v enojne verige z uporabo alkalne raztopine.
4. Enoverižna DNA se s kapilarnim prenosom prenese v filtrirno membrano nitroceluloze.
5. Prenesena DNA je trajno pritrjena na membrano.
6. Fiksna DNA na membrani se hibridizira z označenimi sondami.
7. Nevezana DNA se s pranjem spere iz membrane.
8. Rentgenski film je izpostavljen membrani in pripravljen je avtoradiograf.

Southern blot se uporablja za različne vidike molekularne biologije. Uporaben je pri kartiranju RFLP, forenzičnih študijah, metilaciji DNA pri izražanju genov, odkrivanju mutiranih genov pri genetskih motnjah, odvzemu prstnih odtisov DNA itd.

Slika 01: Tehnika južnega blottinga

Kaj je Northern Blotting?

Northern blot je metoda, zasnovana za odkrivanje določenega zaporedja RNA ali zaporedja mRNA iz vzorca za proučevanje izražanja genov. To tehniko so razvili Alwine, Kemp in Stark leta 1979. Od tehnik pihanja po jugu in zahodu se razlikuje po več korakih. Vendar se ta tehnika izvaja tudi z gelsko elektroforezo, blotiranjem in hibridizacijo s posebnimi označenimi sondami in detekcijo. Severna blot tehnika se izvaja na naslednji način.

1. RNA se ekstrahira iz vzorca in loči z gelsko elektroforezo.
2. RNA se prenese iz gela na blot-membrano in fiksira.
3. Membrano obdelamo z označeno sondo, pripravljeno iz cDNA ali RNA (sonda dopolnjuje določeno zaporedje v vzorcu).
4. Sondo inkubiramo z membrano, da se veže s posebnim zaporedjem.
5. Nevezane sonde se izperejo.
6. Hibridizirane drobce zazna avtoradiograf.

Northern blot je pomembno orodje pri odkrivanju in kvantificiranju hibridizirane mRNA, proučevanju razgradnje RNA, oceni razpolovnega časa RNA, odkrivanju spajanja RNA, proučevanju izražanja genov itd.

Slika 02: Severna črta

Kaj je Western Blotting?

Western blot je metoda odkrivanja določene beljakovine iz beljakovinske mešanice z uporabo označenih protiteles. Zato je Western blot znan tudi kot imunoblot. To tehniko so Towbin in drugi uvedli leta 1979 in jo zdaj redno izvajajo v laboratorijih za analizo beljakovin. Koraki so naslednji.

1. Iz vzorca se ekstrahirajo beljakovine
2. Beljakovine ločimo po velikosti z elektroforezo v poliakrilamidnem gelu
3. Ločene molekule se z elektroporacijo prenesejo v PVDF membrano ali nitrocelulozno membrano
4. Membrana je blokirana zaradi nespecifične vezave s protitelesi
5. Preneseni proteini so vezani na primarna protitelesa (protitelesa, označena z encimi).
6. Membrano speremo, da odstranimo nespecifično vezana primarna protitelesa
7. Vezana protitelesa zaznamo z dodajanjem substrata in zaznavanjem nastale obarvane oborine

Western blot je koristen pri odkrivanju protiteles proti HIV v vzorcu človeškega seruma. Western blot se lahko uporablja tudi kot potrditveni test za okužbo s hepatitisom B in dokončni test za bolezen norih krav.

Slika 03: Western Blotting

Kakšna je razlika med severnim južnim in zahodnim blotom?

Diff Article Sredina pred mizo

Severni vs južni proti zahodnim blottingom
Vrsta zaznane molekule
Severna črta	Northern blotting zazna določeno zaporedje RNA iz vzorca RNA.
Južni blotting	Southern blotting zazna določeno zaporedje DNA iz vzorca DNA.
Western Blotting	Western blotting zazna specifičen protein iz vzorca beljakovin.
Vrsta gela
Severna črta	Pri tem se uporablja agarozni / formaldehidni gel.
Južni blotting	Pri tem se uporablja gel Agarose.
Western Blotting	Pri tem se uporablja poliakrilamidni gel.
Metoda brisanja
Severna črta	To je kapilarni prenos.
Južni blotting	To je kapilarni prenos.
Western Blotting	To je električni prenos.
Uporabljene sonde
Severna črta	sonde cDNA ali RNA, označene radioaktivno ali neradioaktivno.
Južni blotting	DNK sonde so označene radioaktivno ali neradioaktivno.
Western Blotting	Primarna protitelesa se uporabljajo kot sonde.
Sistem za zaznavanje
Severna črta	To se naredi z avtoradiografom ali zaznavanjem spremembe svetlobe ali barve.
Južni blotting	To se naredi z avtoradiografom, zaznavanjem spremembe svetlobe ali barve.
Western Blotting	To se naredi z zaznavanjem spremembe svetlobe ali barve.

Povzetek - Severni vs Južni vs Zahodni blotting

Blotting je posebna tehnika, razvita za identifikacijo specifične DNA, RNA ali beljakovin iz vzorcev. Obstajajo trije ločeni postopki blotiranja, in sicer severni, južni in zahodni, za odkrivanje določene vrste molekule. Northern blot tehnika je zasnovana za odkrivanje določenega zaporedja RNA iz mešanice RNA. Southern blot tehnika omogoča zaznavanje določenega zaporedja DNA iz vzorca DNA, Western blot tehnika pa je razvita za identifikacijo določenega proteina iz beljakovinske mešanice.