Ključna razlika - kloniranje in subkloniranje
Kloniranje in subkloniranje sta molekularno biološka postopka, ki ustvarjata genetsko enake celice ali organizme, ki nosijo DNA ali gen, ki sta zanimiva. Kloniranje je tehnika, ki vključuje vstavitev zainteresiranega gena ali DNA v vektor, njegovo replikacijo v gostiteljski bakteriji in proizvodnjo celic ali organizmov, ki so natančne kopije genske sestave. Subkloniranje je tehnika, ki vključuje vstavljanje gena, ki je že vstavljen v vektor, v sekundarni vektor, njegovo replikacijo v gostiteljski bakteriji in proizvodnjo gensko enakih kopij celic ali organizmov. Ključna razlika med kloniranjem in subkloniranjem je v tem, da pri kloniranju gen, ki ga zanima, potem ko je vezan v vektor, nadaljuje postopek kloniranja, medtem ko v subkloniranjuže klonirani gen, ki nas zanima, se loči od nadrejenega vektorja in znova vstavi v vektor prejemnika ter nadaljuje postopek.
VSEBINA
1. Pregled in ključna razlika
2. Kaj je kloniranje
3. Kaj je subkloniranje
4. Vzporedna primerjava - Kloniranje in subkloniranje
5. Povzetek
Kaj je kloniranje?
Kloniranje je postopek, pri katerem nastanejo gensko enaki organizmi ali celice. V naravi se kloniranje dogaja v sredstvih nespolnega razmnoževanja. Kadar ni genetske rekombinacije ali spremembe, hčerinske celice dobijo enako genetsko sestavo kot starš. Prokariontski in evkariontski organizmi ustvarjajo klone z binarno cepitvijo, brstenjem, mitozo itd. V molekularni biologiji so kloniranje genov ali specifičnih fragmentov DNA priljubljena metoda za preučevanje strukture in delovanja tega določenega odseka DNA.
Glavni cilj molekularnega kloniranja je izdelati milijone kopij gensko enakih celic ali organizmov, ki vsebujejo fragment DNA, ki nas zanima (predvsem geni). Ustvarja organizme z natančnimi genetskimi kopijami drugega. V molekularnih študijah se klonirajo predvsem določeni geni, da se pridobijo strukturne in funkcionalne informacije ter sekvenciranje DNA. Tudi za proizvodnjo specifičnih beljakovin ali izdelkov v velikem obsegu se pogosto uporablja kloniranje.
Postopek kloniranja
Osnovni koraki postopka kloniranja so naslednji.
- Identifikacija in izolacija gene, ki nas zanima. (Ojačanje gena, ki nas zanima, s PCR).
- Omejitev prebave gene, ki nas zanima (Restrikcijska endonukleaza je prerezala gen).
- Omejitev prebave vektorske DNA. (Vektorska DNA se reže tudi z isto restrikcijsko endonukleazo).
- Vstavitev gena v vektor in tvorba rekombinantne molekule.
- Preoblikovanje rekombinantnega vektorja v gostiteljsko bakterijo.
- Izolacija in identifikacija transformiranih bakterij (plazmidni vektor mora vsebovati izbirni gen, najpogosteje gen za odpornost na antibiotike za presejanje transformiranih bakterij).
- Ekspresija rekombinantnega gena znotraj gostitelja.
Slika_01: Postopek kloniranja
Kaj je subkloniranje?
Subkloniranje je postopek premikanja gena, ki nas zanima, iz enega vektorja v drugega, da se vidi ekspresija gena, da dobimo želeno funkcionalnost gena. Pri tej metodi sta vključena dva vektorja; in sicer nadrejeni vektor in ciljni vektor. Klonirani vložki se v podkloniranju ponovno premaknejo v drugi vektor. Cilj prenosa gena iz prvega vektorja v drugega je pridobiti nekaj, česar prvi vektor ne bi mogel storiti, ali pa spet ločiti gen znotraj že kloniranega fragmenta DNA in ga ekspresirati sam. V tem postopku se na začetku uporabljajo encimi za omejevanje.
Postopek subkloniranja
Osnovni koraki subkloniranja so naslednji.
- S pomočjo restrikcijskih endonukleaz ločitev DNK, ki nas zanima, v donatorskem plazmidu (nadrejeni vektor).
- Ojačitev DNA, ki nas zanima, s pomočjo PCR.
- Čiščenje produkta PCR (DNA, ki nas zanima) z gelsko elektroforezo.
- Odpiranje prejemniškega plazmida z enakimi restrikcijskimi endonukleazami, ki se uporabljajo za ločevanje DNA, ki nas zanima, v matičnem plazmidu.
- Ligacija DNA (gena), ki nas zanima, v prejemniški plazmid, da se ustvari subklonirani plazmid.
- Pretvorba subkloniranega vektorja v kompetentno gostiteljsko bakterijo.
- Pregled preoblikovanih celic.
- Čiščenje plazmidne DNA in uporaba za zaporedje DNA ali ekspresijo genov za pridobitev želenih produktov.
Subkloniranje se izvede ob izolaciji enega gena iz klonirane skupine genov ali kadar je potrebni gen za prenos v uporaben plazmid, da se vidi natančna funkcija gena, ki nas zanima.
Slika_02: Postopek subkloniranja
Kakšna je razlika med kloniranjem in subkloniranjem?
Diff Article Sredina pred mizo
Kloniranje in subkloniranje |
|
| Kloniranje je postopek, pri katerem nastanejo gensko enaki organizmi ali celice. | Subkloniranje je postopek premikanja gena, ki nas zanima, iz enega vektorja v drugega, da se vidi ekspresija gena, da dobimo želeno funkcionalnost gena. |
| Proces | |
| DNK, ki nas zanima, ločite od organizma in jo enkrat vstavite v vektor ter ga klonirajte | Že klonirano DNA ločimo od prvega vektorja, vstavimo v drugega in kloniramo. |
| Vstavite gibanje prek vektorjev | |
| Ne premika vstavkov (DNA, ki nas zanima) iz enega v drugega vektorja. | Premaknite vložke iz nadrejenega vektorja v ciljni vektor. |
Povzetek - Kloniranje in subkloniranje
Kloniranje ustvarja genetsko enake celice ali organizme z vstavljenim genom ali DNA, ki nas zanima. Nadaljuje se z ločevanjem in vstavitvijo DNA, ki nas zanima, v vektor in ekspresijo v gostiteljski bakteriji. Podkloniranje ima podobne korake kot kloniranje. Pri subkloniranju pa se že klonirani fragment DNA (gen, ki nas zanima) vstavi v vektor in pretvori v gostiteljsko bakterijo. To je ključna razlika med kloniranjem in subkloniranjem.
