Ključna razlika - zaporedje NGS in Sanger
Sekvenciranje naslednje generacije (NGS) in Sangerjevo zaporedje sta dve vrsti tehnik sekvenciranja nukleotidov, razvitih skozi čas. Metoda Sangerjevega zaporedja se je že vrsto let pogosto uporabljala, NGS pa jo je pred kratkim zamenjal zaradi svojih prednosti. Ključna razlika med NGS in Sanger Sequencing je v tem, da NGS deluje na principu zaporednega zaporedja milijonov zaporedij hkrati na hiter način skozi sistem zaporedja, medtem ko Sanger Sequencing deluje na glavnem delu prekinitve verige zaradi selektivne vključitve dideoksinukleotidov z encimom DNA polimeraze med replikacijo DNA in posledično ločitvijo fragmentov s kapilarno elektroforezo.
VSEBINA
1. Pregled in ključna razlika
2. Kaj je sekvenciranje nukleotidov
3. Kaj je NGS
4. Kaj je sekvenciranje Sanger
5. Vzporedna primerjava - sekvenciranje NGS proti Sangerju
6. Povzetek
Kaj je zaporedje nukleotidov?
Genetske informacije so shranjene v nukleotidnih sekvencah DNA ali RNA organizma. Postopek določanja pravilnega vrstnega reda nukleotidov (z uporabo štirih baz) v danem fragmentu (v genu, grozdu genov, kromosomu in celotnem genomu) je znan kot zaporedje nukleotidov. V genomskih študijah, forenzičnih študijah, virologiji, biološki sistematiki, medicinski diagnostiki, biotehnologiji in na številnih drugih področjih je zelo pomembno analizirati strukturo in delovanje genov. Znanstveniki so razvili različne vrste sekvenciranja. Med njimi je bilo zaporedje Sanger, ki ga je leta 1977 razvil Frederick Sanger, široko uporabljano in popularizirano dolgo, dokler ga ni zamenjalo zaporedje naslednje generacije.
Kaj je NGS?
Sekvenciranje naslednje generacije (NGS) je izraz, ki se uporablja za sodobne procese zaporedja z visoko prepustnostjo. Opisuje številne različne sodobne tehnologije zaporedja, ki so revolucionirale genomske študije in molekularno biologijo. Te tehnike so zaporedje Illumina, zaporedje Roche 454, zaporedje Ion Proton in zaporedje SOLiD (zaporedje z zaznavanjem povezave Oligo) Sistemi NGS so hitrejši in cenejši. V sistemih NGS se uporabljajo štiri glavne metode zaporedja DNA; piro sekvenciranje, sekvenciranje s sintezo, sekvenciranje s ligacijo in ionsko polprevodniško sekvenciranje. Vzporedno lahko sekvenciramo veliko število verig DNA ali RNA (na milijone). Omogoča zaporedje celotnega genoma organizmov v kratkem časovnem obdobju, za razliko od zaporedja Sanger, ki traja več časa.
NGS ima številne prednosti v primerjavi s klasično Sangerjevo metodo zaporedja. To je hiter, natančnejši in stroškovno učinkovitejši postopek, ki ga je mogoče izvesti z majhno velikostjo vzorca. NGS se lahko uporablja v metagenomskih študijah, pri odkrivanju sprememb znotraj posameznega genoma zaradi vstavitev in izbrisov itd. In pri analizi genske ekspresije.
Slika_1: Razvoj zaporedja NGS
Kaj je zaporedje Sangerja?
Sangerjevo zaporedje je metoda zaporedja, ki so jo leta 1977 razvili Frederick Sanger in njegovi kolegi, da bi določili natančen vrstni red nukleotidov danega fragmenta DNA. Znano je tudi kot zaporedje prekinitev verige ali zaporedje Dideoxy. Delovno načelo te metode je končanje sinteze verige s selektivnim vključevanjem verige, ki zaključuje dideoksinukleotide (ddNTP), kot so ddGTP, ddCTP, ddATP in ddTTP, z DNA polimerazo med replikacijo DNA. Običajni nukleotidi imajo 3 'OH skupine za tvorbo fosfodiesterske vezi med sosednjimi nukleotidi za nadaljevanje tvorbe verige. Vendar pa ddNTP nimajo te 3 'OH skupine in ne morejo tvoriti fosfodiesterskih vezi med nukleotidi. Zato se raztezanje verige neha.
Pri tej metodi enoverižna DNA, ki jo je treba sekvencirati, služi kot vzorčna veriga za sintezo in vitro DNA. Druge zahteve so oligonukleotidni primer, predhodniki deoksinukleotida in encim DNA polimeraze. Ko so obrobni konci ciljnega fragmenta znani, lahko primerje enostavno oblikujemo za replikacijo DNA. V štirih ločenih epruvetah se izvajajo štiri ločene reakcije sinteze DNA. Vsaka cev ima ločene ddNTP, skupaj z drugimi zahtevami. Iz določenega nukleotida se doda mešanica dNTP in ddNTP. Prav tako se v štirih epruvetah s štirimi zmesmi izvedejo štiri ločene reakcije. Po reakcijah se izvede odkrivanje fragmentov DNA in pretvorba vzorca fragmenta v informacije o zaporedju. Nastali fragmenti DNA se toplotno denaturirajo in ločijo z gelsko elektroforezo. Če uporabimo radioaktivne nukleotide, lahko vzorec trakov v poliakrilamidnem gelu vizualiziramo z avtoradiografijo. Ko ta metoda uporablja fluorescentno označene dideoksinukleotide, jo lahko omilimo po odčitanem gelu in jo speljemo skozi laserski žarek, ki ga zazna fluorescenčni detektor. Da bi se izognili napakam, ki bi lahko nastale, ko zaporedje prebere oko in ga ročno vnesemo v računalnik, se je ta metoda razvila v uporabo avtomatiziranega sekvencerja, povezanega z računalnikom. Da bi se izognili napakam, ki bi lahko nastale, ko zaporedje prebere oko in ga ročno vnesemo v računalnik, se je ta metoda razvila v uporabo avtomatiziranega sekvencerja, povezanega z računalnikom. Da bi se izognili napakam, ki bi lahko nastale, ko zaporedje prebere oko in ga ročno vnesemo v računalnik, se je ta metoda razvila v uporabo avtomatiziranega sekvencerja, povezanega z računalnikom.
To je metoda, ki se uporablja za zaporedje DNA iz projekta Human Genome. Ta metoda se še vedno uporablja z naprednimi spremembami, ker daje natančne informacije o zaporedju, čeprav je drag in počasen postopek.
Slika_2: Zaporedje Sangerja
Kakšna je razlika med NGS in Sanger Sequencing?
Diff Article Sredina pred mizo
NGS vs Sanger Sekvenciranje |
|
| Sekvenciranje naslednje generacije (NGS) se nanaša na sodobne procese zaporedja z visoko prepustnostjo. Opisuje številne različne sodobne tehnologije zaporedja | Sangerjevo zaporedje je metoda zaporedja, ki jo je razvil Frederick Sanger, da bi določil natančen vrstni red nukleotidov danega fragmenta DNA. |
| Stroškovna učinkovitost | |
| NGS je cenejši postopek, saj zmanjšuje čas, človeško moč in kemikalije. | To je drag postopek, saj zahteva čas, človeško moč in več kemikalij. |
| Hitrost | |
| To je hitreje, saj se tako zaznavanje kemikalij kot zaznavanje signalov številnih pramenov izvajata vzporedno. | To je dolgotrajno, saj se zaznavanje kemikalij in zaznavanje signalov odvijata kot dva ločena procesa in hkrati lahko bereta le na pramenu. |
| Zanesljivost | |
| NGS je zanesljiv. | Sangerjevo zaporedje je manj zanesljivo |
| Velikost vzorca | |
| NGS zahteva manj količine DNA. | Ta metoda potrebuje veliko količino vzorčne DNA. |
| Baze DNA na zaporedni fragment | |
| Število baz DNA na sekvencirani fragment je manjše od Sangerjeve metode | Ustvarjalna zaporedja so daljša od zaporedij NGS. |
Povzetek - Sekvenciranje NGS proti Sangerju
NGS in Sanger Sequencing sta nukleotidni tehniki sekvenciranja, ki se pogosto uporablja v molekularni biologiji. Sangerjevo zaporedje je zgodnja metoda zaporedja, ki jo je nadomestil NGS. Glavna razlika med NGS in Sangerjevim zaporedjem je, da je NGS hiter, natančnejši in stroškovno učinkovitejši postopek kot Sangerjevo zaporedje. Obe tehniki sta povzročili velike izbruhe v genetiki in biotehnologiji.
