Ključna razlika - sekvenciranje mikromrež in RNA
Transkriptom predstavlja celotno vsebnost RNA, prisotne v celici, vključno z mRNA, rRNA, tRNA, razgrajeno RNA in nerazgrajeno RNA. Profiliranje transkriptoma je pomemben postopek za razumevanje celičnih vpogledov. Obstaja več naprednih metod za profiliranje transkriptoma. Mikroreše in zaporedje RNA sta dve vrsti tehnologij, razvitih za analizo transkriptoma. Ključna razlika med sekvenciranjem mikromrež in RNA je v tem, da mikromreža temelji na hibridizacijskem potencialu vnaprej oblikovanih označenih sond s ciljnimi sekvencami cDNA, medtem ko sekvenciranje RNA temelji na neposrednem sekvenciranju verig cDNA z naprednimi tehnikami sekvenciranja, kot je NGS. Mikrorezi se izvaja s predhodnim znanjem o sekvencah, sekvenciranje RNA pa brez predhodnega znanja o sekvencah.
VSEBINA
1. Pregled in ključna razlika
2. Kaj je mikromreža
3. Kaj je sekvenciranje RNK
4. Vzporedna primerjava - mikromreža in sekvenciranje RNA
5. Povzetek
Kaj je Microarray?
Microarray je robustna, zanesljiva in visoko zmogljiva metoda, ki jo znanstveniki uporabljajo za profiliranje transkriptoma. Je najbolj priljubljen pristop za analizo prepisov. To je poceni metoda, ki je odvisna od hibridizacijskih sond.
Tehnika se začne z ekstrakcijo mRNA iz vzorca in izgradnjo knjižnice cDNA iz celotne RNA. Nato se na trdni površini (točkovna matrica) zmeša s fluorescentno označenimi vnaprej zasnovanimi sondami. Komplementarna zaporedja se hibridizirajo z označenimi sondami v mikromreži. Nato mikrometino speremo in presejemo ter sliko kvantificiramo. Zbrane podatke je treba analizirati, da dobimo relativne profile izraza.
Intenzivnost sond mikromrež naj bi bila sorazmerna s količino prepisov v vzorcu. Vendar je natančnost tehnike odvisna od zasnovanih sond, predhodnega poznavanja zaporedja in afinitete sond za hibridizacijo. Tehnologija mikromrež ima zato omejitve. Tehnike mikromrež ni mogoče izvesti s prepisi z majhno številčnostjo. Ne uspe razlikovati izooblik in identificirati genetskih variant. Ker je ta metoda odvisna od hibridizacije sond, se v tehniki mikromrež pojavijo nekateri problemi, povezani s hibridizacijo, kot so navzkrižna hibridizacija, nespecifična hibridizacija itd.
Slika 01: Microarray
Kaj je zaporedje RNA?
Sekvenciranje pušk RNA (RNA seq) je nedavno razvita celotna tehnika zaporedja transkriptomov. To je hitra in visoko zmogljiva metoda profiliranja transkriptoma. Neposredno kvantificira izražanje genov in ima za posledico globoko preiskavo transkriptoma. RNA seq ni odvisna od vnaprej zasnovanih sond ali predhodnega znanja o sekvencah. Zato ima metoda RNA seq visoko občutljivost in sposobnost odkrivanja novih genov in genetskih variant.
Metoda zaporedja RNA se izvaja v več korakih. Celotna RNA celice mora biti izolirana in razdrobljena. Nato je treba z uporabo reverzne transkriptaze pripraviti knjižnico cDNA. Vsak sklop cDNA je treba povezati z adapterji. Nato je treba povezovane fragmente ojačati in očistiti. Na koncu z uporabo metode NGS je treba izvesti zaporedje cDNA.
Slika 02: Zaporedje RNA
Kakšna je razlika med zaporedjem mikromrež in RNA?
Diff Article Sredina pred mizo
Microarray vs RNA Sekvenciranje |
|
| Microarray je robustna, zanesljiva metoda z visoko prepustnostjo. | Zaporedje RNA je natančna in visoko zmogljiva metoda. |
| Stroški | |
| To je poceni metoda. | To je draga metoda. |
| Analiza velikega števila vzorcev | |
| To olajša analizo večjega števila vzorcev hkrati. | To olajša analizo velikega števila vzorcev. |
| Analiza podatkov | |
| Analiza podatkov je zapletena. | S to metodo se ustvari več podatkov; zato je postopek bolj zapleten. |
| Predhodno poznavanje zaporedij | |
| Ta metoda temelji na hibridizacijskih sondah, zato je potrebno predhodno znanje o zaporedjih. | Ta metoda ni odvisna od predhodnega znanja o zaporedju. |
| Strukturne variacije in novi geni | |
| Ta metoda ne more zaznati strukturnih sprememb in novih genov. | Ta metoda lahko zazna strukturne razlike, kot so spajanje genov, alternativno spajanje in novi geni. |
| Občutljivost | |
| To ne more zaznati razlik v izražanju izooblik, zato je ta občutljivost omejena. | Ta ima visoko občutljivost. |
| Izid | |
| To lahko povzroči le relativne ravni izražanja. To ne daje absolutne količinske opredelitve izražanja genov. | Podaja absolutne in relativne ravni izražanja. |
| Ponovna analiza podatkov | |
| To je treba ponoviti, da se ponovno analizira. | Podatke o zaporedju je mogoče ponovno analizirati. |
| Potreba po posebnem osebju in infrastrukturi | |
| Za mikromrežo ni potrebna posebna infrastruktura in osebje. | Posebna infrastruktura in osebje, ki jih zahteva zaporedje RNA. |
| Tehnična vprašanja | |
| Tehnika mikromrež ima tehnične težave, kot so navzkrižna hibridizacija, nespecifična hibridizacija, omejena stopnja zaznavanja posameznih sond itd. | Tehnika RNA seq se izogne tehničnim težavam, kot so navzkrižna hibridizacija, nespecifična hibridizacija, omejena stopnja zaznavanja posameznih sond itd. |
| Pristranskosti | |
| To je pristranska metoda, saj je odvisna od hibridizacije. | V primerjavi z mikromrežami je pristranskost nizka. |
Povzetek - Sekvenciranje mikromrež proti RNA
Metode sekvenciranja mikromrež in RNA so visoko zmogljive platforme, razvite za profiliranje transkriptoma. Obe metodi dajeta rezultate, ki so močno povezani s profili ekspresije genov. Sekvenciranje RNA pa ima prednosti pred mikromrežami za analizo ekspresije genov. Sekvenciranje RNA je bolj občutljiva metoda za odkrivanje prepisov z majhno številčnostjo kot mikromreža. Sekvenciranje RNA omogoča tudi razlikovanje med izooblikami in identifikacijo genskih različic. Vendar je mikromreža pogosta izbira večine raziskovalcev, saj je zaporedje RNA nova in draga tehnika z izzivi shranjevanja podatkov in zapleteno analizo podatkov.
