Ključna razlika - PCR proti zaporedju DNA
PCR in zaporedje DNA sta dve pomembni tehniki molekularne biologije. Verižna reakcija s polimerazo (PCR) je postopek, ki ustvari veliko število kopij fragmenta DNA. Sekvenciranje DNA je tehnika, ki povzroči natančen vrstni red nukleotidov danega fragmenta DNA. To je ključna razlika med PCR in zaporedjem DNA. PCR je eden glavnih korakov pri zaporedju DNA.
VSEBINA
1. Pregled in ključna razlika
2. Kaj je PCR
3. Kaj je sekvenciranje DNA
4. Vzporedna primerjava - PCR proti sekvenciranju DNA
5. Povzetek
Kaj je PCR?
Verižna reakcija s polimerazo (PCR) je tehnika pomnoževanja DNA, ki se uporablja v molekularni biologiji. Proizvede na tisoče do milijone kopij določenega fragmenta DNA. To metodo je razvil Kary Mullis leta 1983. Pri tej tehniki fragment DNA, ki ga je treba ojačati, služi kot predloga in encim DNA polimeraza doda komplementarne nukleotide v primer, ki je na voljo v mešanici PCR. Na koncu reakcije PCR se sintetizira veliko kopij vzorčne DNA.
Obstajajo različne sestavine mešanice PCR, vključno z DNA, DNA polimerazo (Taq polimeraza), začetniki (naprej in nazaj, primerki), nukleotidi (gradniki DNA) in pufer. PCR se zgodi znotraj PCR naprave, v napravo je treba naložiti pravilno mešanico PCR in zagnati pravilen program. Ta tehnika omogoča izdelavo tisoč do milijonov kopij določenega odseka DNK iz zelo majhne količine DNK.
PCR reakcije potekajo ciklično, da na gelu nastanejo vidne količine produktov PCR. V reakciji PCR so vključeni trije glavni koraki, in sicer denaturacija, žarjenje temeljnega premaza in podaljšanje pramenov, kot je prikazano na sliki 01. Ti trije koraki potekajo pri treh različnih temperaturah. DNA obstaja v dvoverižni obliki z vodikovimi vezmi med komplementarnimi bazami. Pred implikacijo je treba dvoverižno DNA ločiti med seboj. To se naredi z visoko temperaturo. Pri visoki temperaturi dvoverižna DNA denaturacija v enojne verige. Nato naj se primerji približajo obrobnim koncem določenega fragmenta ali gena DNA. Primer je kratek kos enoverižne DNA, ki dopolnjuje ciljno zaporedje. Prednji in vzvratni temeljni premaz žarimo s komplementarnimi bazami na bočnih koncih denaturirane vzorčne DNA pri temperaturi žarjenja. Temeljni premazi naj bodo odporni na toploto. Enkrat, ko primere žari z vzorčno DNA, encim taq polimeraza sproži sintezo novih verig z dodajanjem nukleotidov, ki dopolnjujejo ciljno DNA. Taq polimeraza je toplotno stabilen encim, izoliran iz termofilne bakterije, imenovane Thermus aquaticus. PCR pufer ohranja optimalne pogoje za delovanje taq polimeraze. Te tri faze PCR reakcij se ponovijo, da nastane zahtevana količina PCR produkta. Po vsaki reakciji PCR se število kopij DNA podvoji. Zato lahko pri PCR opazimo eksponentno ojačanje. Izdelke PCR lahko opazujemo z gelno elektroforezo in jih lahko očistimo za nadaljnje študije.
Slika 01: Glavni koraki reakcije PCR
PCR je dragoceno orodje v medicinskih in bioloških raziskavah. PCR ima posebno vrednost v forenzični znanosti, saj lahko ojača DNK za študije na majhnih vzorcih kriminalcev in izdela forenzične profile DNK. PCR se pogosto uporablja na številnih področjih molekularne biologije, vključno z genotipizacijo, kloniranjem genov, odkrivanjem mutacij, sekvenciranjem DNA, DNA mikromrežami in testiranjem očetovstva itd.
Slika 02: Verižna reakcija polimeraze
Kaj je zaporedje DNA?
Sekvenciranje DNA je določitev natančnega vrstnega reda nukleotidov - adenina, gvanina, citozina in timina v danem fragmentu DNA. Genetske informacije se shranijo v zaporedjih DNA po pravilnem vrstnem redu nukleotidov. Zato je najti natančen vrstni red nukleotidov v fragmentu DNA zelo pomembno, da vemo o strukturi in delovanju genov.
Protokol sekvenciranja DNA vključuje različne procese. Prvi korak je izolacija zainteresirane DNA ali genomske DNA organizma. S pomočjo PCR (kot je opisano zgoraj) je treba ojačati želeno regijo DNA. Ojačani PCR izdelek je treba ločiti z gelno elektroforezo in očistiti. Ojačani fragmenti služijo kot predloge za zaporedje. Zaporedje je mogoče izvesti bodisi po Sangerjevem zaporedju bodisi po visoki prepustnosti. Za zaporedje Sangerja je potrebna kapilarna elektroforeza nastalih fragmentov DNA. Pravilni vrstni red nukleotidov lahko določimo z ročnim branjem avtoradiografov ali z uporabo avtomatiziranih zaporednikov DNA.
Sekvenciranje genov je prispevalo k projektu Človeški genom in olajšalo preslikavo človeškega genoma leta 2003. V forenziki je sekvenciranje DNK omogočilo identifikacijo posameznikov, ki kažejo edinstvena zaporedja DNK in prepoznajo kriminalce. V medicini lahko sekvenciranje DNA uporablja za odkrivanje genov, odgovornih za genetske in druge bolezni, iskanje genov z napako in njihovo nadomeščanje s pravilnimi geni. V kmetijstvu se podatki o zaporedju DNA nekaterih mikroorganizmov uporabljajo za pridelavo transgenih pridelkov z ekonomsko želenimi lastnostmi.
Slika 03: Sekvenciranje DNA
Kakšna je razlika med PCR in zaporedjem DNA?
Diff Article Sredina pred mizo
PCR proti zaporedju DNA |
|
| Proces PCR ustvari na tisoče do milijone kopij zainteresiranega fragmenta DNA. | Sekvenciranje DNA je postopek določanja natančnega vrstnega reda nukleotidov v danem fragmentu DNA. |
| Izid | |
| PCR ustvari na tisoče do milijone kopij določenega fragmenta DNA | Rezultat je pravilen vrstni red baz v določenem fragmentu DNA. |
| Vključenost ddNTP | |
| PCR ne zahteva ddNTP. Uporablja dNTP. | Za zaporedje DNA so potrebni ddNTP, da končajo tvorbo verige. |
Povzetek - PCR proti zaporedju DNA
PCR in zaporedje DNA sta zelo pomembni orodji na mnogih področjih molekularne biologije. Amplifikacija fragmentov DNA se opravi s PCR tehniko, pravilen vrstni red nukleotidov fragmenta DNA pa se določi z zaporedjem DNA. To je razlika med PCR in zaporedjem DNA.
