Ključna razlika - zaporedje Maxam Gilbert proti Sangerju
Nukleotidi so osnovne strukturne enote in gradniki DNA. Molekula DNA je sestavljena iz polinukleotidne verige. V DNK najdemo štiri različne nukleotide. Ti nukleotidi so sestavljeni iz štirih različnih dušikovih baz, imenovanih A (adenin), G (gvanin), C (citozin), T (timin). Vrstni red nukleotidov v molekuli DNA ima velik pomen, saj kodira pomembne genetske informacije za rast in razvoj organizmov. Sekvenciranje DNA se nanaša na postopek, ki določa natančno nukleotidno zaporedje DNA. Obstajajo različne metode zaporedja DNA. Maxam Gilbert zaporedje in Sanger DNA zaporedje sta dve metodi zaporedja DNA, ki spadata v zaporedje prve generacije. Postopek sekvenciranja Maxam Gilbert določa osnovno zaporedje s kemičnim odsekanjem 5 'končno označenih fragmentov DNA prednostno na vsakem od štirih nukleotidov in gel elektroforeze. Postopek Sangerjevega zaporedja določa nukleotidno zaporedje s sintezo enoverižne DNA z uporabo DNA polimeraze in dideoksinukleotidov ter gelsko elektroforezo. To je ključna razlika med zaporedjem Maxam Gilbert in Sanger.
VSEBINA
1. Pregled in ključna razlika
2. Kaj je Maxam Gilbert
3. Kaj je Sangerjevo zaporedje
4. Vzporedna primerjava - Maxam Gilbert proti Sangerjevem zaporedju
5. Povzetek
Kaj je zaporedje Maxam Gilbert?
Maxam Gilbert sekvenciranje, znano tudi kot metoda kemijskega sekvenciranja, je tehnika, ki je bila razvita za določitev vrstnega reda nukleotidov v DNA. To metodo sta Walter Gilbert in Alan Maxam predstavila leta 1976 in je postala priljubljena, saj jo je mogoče izvajati neposredno s prečiščeno DNA. Metoda Maxam Gilbert spada v prvo generacijo zaporedja DNA in je bila prva metoda zaporedja, ki so jo znanstveniki pogosto uporabljali.
Osnovno načelo te metode je omejevanje končno označenih fragmentov DNA na določenih bazah s pomočjo kemikalij in pogojev, specifičnih za bazo, in ločevanje označenih fragmentov z elektroforezo, kot je prikazano na sliki 01. Fragmenti so ločeni glede na njihovo velikost na gel. Ker so fragmenti označeni, lahko zaporedje molekule DNA zlahka ugotovimo.
Metoda Maxam gilbert uporablja kemikalije, specifične za bazo, za razbijanje DNA na določenih osnovah. Dve pogosti kemikaliji, imenovani dimetil sulfat in hidrazin, se uporabljata za selektivni napad na purine oziroma pirimidine.
Metoda zaporedja Maxam Gilbert se izvaja v več korakih, kot sledi.
- Čiščenje zaporedja DNA z uporabo restrikcijskih endonukleaz
- Označevanje koncev fragmentov DNA z dodajanjem radioaktivnih fosfatov
- Čiščenje označenih fragmentov iz neoznačenih fragmentov z gelsko elektroforezo
- Ločitev končno označene DNA v štiri epruvete in ločeno obdelavo z osnovnimi kemikalijami
- Elektroforeza vsebine vsake epruvete na ločenih linijah na ločevanju gela in fragmentov glede na njihovo dolžino.
- Odkrivanje drobcev z avtoradiografom.
Slika 01: Zaporedje Maxam Gilbert
Kaj je zaporedje Sangerja?
Sangerjevo zaporedje je metoda zaporedja, ki so jo leta 1977 razvili Frederick Sanger in njegovi kolegi za določitev osnovnega zaporedja danega fragmenta DNA. Znano je tudi kot zaporedje prekinitev verige ali metoda zaporedja Dideoxy. Ta metoda deluje na principu selektivnega vključevanja verižnih zaključnih dideoksinukleotidov (ddNTP), kot so ddGTP, ddCTP, ddATP in ddTTP, z DNA polimerazo med sintezo enoverižne DNA za zaključek tvorbe verige. Dideoksinukleotidi nimajo 3 'OH skupin za tvorbo fosfodiesterskih vezi s sosednjim nukleotidom. Zato se tvorba pramenov ustavi, ko je ddNTP vključen v novo nastajajočo verigo med zaporedjem sangerjev.
Pri tej metodi se v štirih ločenih epruvetah z eno vrsto ddNTP izvedejo štiri ločene reakcije sinteze DNA (PCR). Za epruvete za PCR so na voljo tudi druge zahteve, vključno s primerji, dNTP, Taq polimerazo, posebnimi pogoji itd. V štirih epruvetah s štirimi mešanicami se izvedejo štiri ločene reakcije. Po reakcijah PCR nastale fragmente DNA toplotno denaturiramo in ločimo z gelsko elektroforezo. Nato se fragmenti vizualizirajo z uporabo označenega (radioaktivnega ali fluorescentnega) osnovnega premaza ali dNTP, kot je prikazano na sliki 02.
Slika 02: Sangerjevo zaporedje
Kakšna je razlika med zaporedjem zaporedja Maxam Gilbert in Sanger?
Diff Article Sredina pred mizo
Maxam Gilbert proti Sanger Sekvenciranje |
|
| Maxam Gilbert sekvenciranje je prva tehnika, razvita za sekvenciranje DNA. | Metoda zaporedja Sanger je bila uvedena po metodi zaporedja Maxam Gilbert. |
| Uporaba | |
| Ta metoda se redko uporablja. | Za zaporedje se rutinsko uporablja zaporedje Sanger. |
| Uporaba nevarnih kemikalij | |
| Uporablja nevarne kemikalije. | Uporaba nevarnih kemikalij je v primerjavi z metodo Maxam Gilbert omejena. |
| Označevanje za odkrivanje | |
| Ta metoda uporablja radioaktivni P 32 za označevanje koncev fragmentov DNA. | Sangerjevo zaporedje uporablja radioaktivno ali fluorescentno označene ddNTP. |
Povzetek - Maxam Gilbert proti Sanger Sequencing
Maxam Gilbert in Sanger zaporedje sta dve vrsti tehnik zaporedja DNA, ki spadata v zaporedje DNA prve generacije. Maxam Gilbert sekvenciranje je prva metoda, ki je bila uvedena za sekvenciranje DNA leta 1976 in se izvaja z lomljenjem končno označenih fragmentov DNA s kemikalijami, specifičnimi za bazo. Zato je znano kot kemijsko zaporedje. Metoda zaporedja Sanger je bila uvedena leta 1977 in temelji na reakcijah zaključevanja verige, ki jih poganja ddNTP. Sangerjeva metoda zaporedja je priljubljena kot metoda Maxam Gilbert zaradi številnih pomanjkljivosti metode Maxam Gilbert, kot so pretirana poraba časa, uporaba nevarnih kemikalij itd. To je razlika med zaporedjem Maxam Gilbert in Sanger.
