Ključna razlika - Sangerjevo zaporedje proti pirozaporedju
Za analizo DNK je zaporedje DNA zelo pomembno, saj poznavanje pravilne razporeditve nukleotidov na določeni regiji DNA razkrije veliko pomembnih informacij o njem. Obstajajo različne metode zaporedja DNA. Sangerjevo zaporedje in pirosekvenciranje sta dve različni metodi zaporedja DNA, ki se pogosto uporabljata v molekularni biologiji. Ključna razlika med Sangerjevim sekvenciranjem in pirosekvenciranjem je v tem, da Sangerjevo zaporedje uporablja dideoksinukleotide za zaključek sinteze DNA za odčitavanje nukleotidnega zaporedja, medtem ko pirosekvenciranje zazna sproščanje pirofosfata z vključitvijo nukleotidov in sintezo komplementarnega zaporedja, da se odčita natančen vrstni red zaporedja.
VSEBINA
1. Pregled in ključna razlika
2. Kaj je Sanger Zaporedje
3. Kaj je Pyrosequencing
4. ob bok Primerjava - Sanger Zaporedje vs Pyrosequencing
5. Povzetek
Kaj je zaporedje Sangerja?
Sangerjevo zaporedje je metoda zaporedja DNK prve generacije, ki so jo razvili Frederick Sanger in njegovi kolegi leta 1977. Znano je tudi kot zaporedje zaključevanja verig ali zaporedje Dideoxy, saj temelji na prekinitvi verige z dideoksinukleotidi (ddNTP). Ta metoda se je pogosto uporabljala več kot 30 let, dokler ni bilo razvito zaporedje nove generacije (NGS). Tehnika zaporedja Sangerja je omogočila odkritje pravilnega reda nukleotidov ali pritrditev določenega fragmenta DNA. Temelji na selektivni vključitvi ddNTP in zaključku sinteze DNA med in vitro replikacijo DNA. Odsotnost 3 'OH skupin za nadaljevanje tvorbe fosfodiesterne vezi med sosednjimi nukleotidi je edinstvena značilnost ddNTP. Ko je ddNTP pritrjen, se raztezek verige ustavi in konča od te točke. Obstajajo štirje ddNTP - ddATP, ddCTP, ddGTP in ddTTP -, ki se uporabljajo pri zaporedju Sanger. Ti nukleotidi ustavijo postopek replikacije DNA, ko so vključeni v rastočo verigo DNA in povzročijo različno dolge kratke DNA. Kapilarna elektroforeza v gelu se uporablja za organiziranje teh kratkih verig DNA po njihovih velikostih na gelu, kot je prikazano na sliki 01.
Slika 1: Kapilarna gelska elektroforeza sintetizirane kratke DNA
Za in vitro replikacijo DNK je treba zagotoviti nekaj zahtev. So encim DNA polimeraze, vzorčna DNA, oligonukleotidni začetniki in deoksinukleotidi (dNTP). Pri Sangerjevem zaporedju se replikacija DNA izvaja v štirih ločenih epruvetah skupaj s štirimi vrstami ddNTP. Deoksinukleotidi niso popolnoma nadomeščeni z ustreznimi ddNTP. Zmes določenega dNTP (na primer dATP + ddATP) je vključena v epruveto in ponovljena. Štirje ločeni cevni izdelki se nanesejo na gel v štirih ločenih jamicah. Nato lahko z branjem gela sestavimo zaporedje, kot je prikazano na sliki 02.
Slika 02: Sangerjevo zaporedje
Sangerjevo zaporedje je pomembna tehnika, ki pomaga na številnih področjih molekularne biologije. Projekt človeškega genoma je bil uspešno zaključen s pomočjo Sangerjevih metod, ki temeljijo na zaporedju. Sekvenciranje po Sangerju je koristno tudi pri sekvenciranju ciljne DNA, raziskavah raka in genskih bolezni, analizi genske ekspresije, identifikaciji človeka, odkrivanju patogenov, mikrobnem zaporedju itd.
Obstaja več slabosti Sangerjevega zaporedja:
- Dolžina zaporedja DNA ne sme biti daljša od 1000 baznih parov
- Naenkrat je mogoče sekvencirati samo en pramen.
- Postopek je dolgotrajen in drag.
Zato so sčasoma razvili nove napredne tehnike zaporedja za premagovanje teh težav. Vendar je Sangerjevo zaporedje še vedno v uporabi zaradi svojih zelo natančnih rezultatov do približno 850 fragmentov dolžine osnovnega para.
Kaj je pirozekvenciranje?
Pirosekvenciranje je nova tehnika sekvenciranja DNA, ki temelji na "sekvenciranju s sintezo". Ta tehnika temelji na detekciji sproščanja pirofosfata ob vključitvi nukleotida. Postopek uporabljajo štirje različni encimi: DNA polimerza, ATP sulfurilaza, luciferaza in apiraza ter dva substrata adenozin 5 'fosfosulfat (APS) in luciferin.
Postopek se začne z vezavo primerja z enoverižno predlogo DNA, DNA polimeraza pa začne z vključevanjem njenih komplementarnih nukleotidov. Ko se nukleotidi združijo (polimerizacija nukleinske kisline), sprosti pirofosfatne (dve fosfatni skupini, povezani skupaj) in energijo. Vsak dodatek nukleotida sprosti ekvimolarno količino pirofosfata. Pirofosfat se v prisotnosti substrata APS pretvori v ATP z ATP sulfurilazo. Ustvarjeni ATP spodbuja pretvorbo luciferina, ki jo posreduje luciferaza, v oksiluciferin, pri čemer nastaja vidna svetloba v količinah, ki so sorazmerne količini ATP. Svetlobo zazna naprava za zaznavanje fotona ali fotomultiplikator in ustvari pirogram. Apiraza razgradi ATP in nevključene dNTP v reakcijski zmesi. dNTP se doda enkrat naenkrat. Ker je dodatek nukleotida znan glede na vključitev in zaznavanje svetlobe, je mogoče določiti zaporedje predloge. Pirogram se uporablja za generiranje nukleotidnega zaporedja vzorčne DNA, kot je prikazano na sliki 03.
Pirosekvenciranje je zelo pomembno pri analizi polimorfizma enojnih nukleotidov in zaporedju kratkih odsekov DNA. Visoka natančnost, prilagodljivost, enostavnost avtomatizacije in vzporedna obdelava so prednosti pirosekvenciranja pred Sangerjevimi tehnikami sekvenciranja.
Slika 03: Pirozekvenciranje
Kakšna je razlika med Sangerjevim zaporedjem in pirorekvenciranjem?
Diff Article Sredina pred mizo
Sangerjevo zaporedje proti pirozaporedju |
|
| Sangerjevo zaporedje je metoda zaporedja DNA, ki temelji na selektivni vključitvi ddNTP z DNA polimerazo in zaključkom verige. | Pirosekvenciranje je metoda zaporedja DNA, ki temelji na detekciji sproščanja pirofosfata ob vključitvi nukleotida. |
| Uporaba ddNTP | |
| ddNTP se uporabljajo za zaustavitev replikacije DNA | ddNTP se ne uporabljajo. |
| Vključeni encimi | |
| Uporablja se DNA polimeraza. | Uporabljajo se štirje encimi: DNA polimeraza, ATP sulfurilaza, luciferaza in apiraza. |
| Uporabljene podlage | |
| APS in Luciferin se ne uporabljata. | Uporabljata se adenozin 5 'fosfosulfat (APS) in luciferin. |
| Najvišja temperatura | |
| To je počasen postopek. | To je hiter postopek. |
Povzetek - Sangerjevo zaporedje proti pirozaporedju
Sangerjevo zaporedje in pirosekvenciranje sta dve metodi zaporedja DNA, ki se uporabljata v molekularni biologiji. Sangerjevo zaporedje gradi zaporedje nukleotidov v zaporedju tako, da konča raztezanje verige, medtem ko pirosekvenciranje gradi natančen vrstni red nukleotidov v zaporedju z vključevanjem nukleotidov in zaznavanjem sproščanja pirofosfatov. Zato je glavna razlika med Sangerjevim zaporedjem in pirosekvenciranjem ta, da Sangerjevo zaporedje deluje na zaporedje s prekinitvijo verige, medtem ko piro sledenje deluje na zaporedje s sintezo.
